medicago 10-0027說明書

Protein L Ligand Leakage ELISA kit

蛋白L配體滲漏ELIS A試劑盒

Product 0-0027 Standard kit

10-0028 XL kit containing extra Protein L Reference

使用前閱讀：·本說明書推薦的樣品制備方法（即。熱處理）已成功地應(yīng)用于一些目標(biāo)分子，包括MAB和Fab。一些法布斯可能，怎么 永遠，需要額外的優(yōu)化。對sdAb分子進行熱處理的初步實驗尚未成功。

蛋白L參考品送凍，應(yīng)保凍..

Table of content

Table of content.......................................................................................................................... 2

Background and intended use .................................................................................................... 2

Warnings and precautions.......................................................................................................... 3

Storage and stability ................................................................................................................... 3

Kit contents ................................................................................................................................ 3

Materials required but not supplied............................................................................................ 3

Sample preparation..................................................................................................................... 4

Reagent preparation.................................................................................................................... 6

Test procedure ............................................................................................................................ 7

Analysis of results...................................................................................................................... 8

Performance ............................................................................................................................... 8

Contact information.................................................................................................................... 8

背景和預(yù)期用途

蛋白質(zhì)L配體泄漏ELISA試劑盒是一種定量的酶聯(lián)免疫吸附試驗。這種ELISA-試劑盒的目的是檢測和量化從蛋白質(zhì)L親和力的洗脫液中的配體泄漏 含有免疫球蛋白（Ig）或Ig-碎片的色譜培養(yǎng)基。

蛋白質(zhì)L配體泄漏ELIS A試劑盒有兩個版本-標(biāo)準(zhǔn)試劑盒（10-0027）和XL試劑盒（10-0028）。XL試劑盒中含有五小瓶的蛋白質(zhì)L參考，而不是一小瓶。 用于工藝適應(yīng)目的。

蛋白質(zhì)L初是從大腸桿菌中分離出來的，并在色譜培養(yǎng)基中作為配體捕獲Ig和Ig片段。蛋白質(zhì)L與變量reg結(jié)合 抗體的kappa輕鏈離子，不干擾抗原結(jié)合位點。這使得蛋白L能夠比其他抗體結(jié)合Pr結(jié)合更廣泛的Ig類和亞類 奧廷斯。此外，蛋白L還結(jié)合抗體片段，如Fabs，單鏈可變片段和結(jié)構(gòu)域抗體，其中含有kappa輕鏈。

蛋白L配體漏ELISA是一種夾心ELISA，在12條的模塊中有96個微滴度井，包覆了一種親和純化的抗蛋白L抗體。一個樣本中的蛋白質(zhì)L的量 用標(biāo)準(zhǔn)曲線測定E，用蛋白質(zhì)L提取參考樣品。

為了將Ig或Ig碎片從蛋白L中分離出來，需要進行樣品制備。對于mAbs和Fabs，樣品是通過煮沸和離心制備的，然后再在條帶中孵育。 埃爾斯。

請注意，對于像sdAb這樣的小Ig碎片，這個樣品制備程序不起作用..需要對sdAb的樣品制備進行額外的優(yōu)化。

需要稀釋參考樣品中的參考標(biāo)準(zhǔn)曲線（來自試劑盒中提供的蛋白質(zhì)L參考）。參考樣品應(yīng)由不同的凈化方法分離出來 請參閱下面樣品準(zhǔn)備部分的更多信息。如果樣品不包含任何Ig或Ig碎片，則不需要煮沸樣品。它們可以直接用于檢測。

警告和注意事項1。在開始檢測之前，仔細閱讀說明書。使用與試劑盒一起提供的說明書的有效版本..2.不要從不同的工具包b中混合組件 阿切斯。3.遵循良好的實驗室實踐和當(dāng)?shù)匕踩珳?zhǔn)則。4.底物溶液（EC-藍色增強液）對眼睛、呼吸道和皮膚有刺激性..停止溶液是一種酸w 希奇會引起灼傷。小心處理。5.不要用嘴吸管。6.不要使用超過到期日期的試劑盒組件。

儲存和穩(wěn)定性·將試劑盒組件存放在4oC。將蛋白質(zhì)L參考品存放在-20oC或-80oC。穩(wěn)定12個月

Kit contents

Component Quantity Handling

Anti-Protein L coated

microtiter plate

1 plate

96 wells

12 × 8-well strips

Ready to use. Let the plate reach room temperature

before opening the bag. If only part of the plate is used,

store unused strips in a sealed bag at +4ºC.

HRP-conjugated anti-Protein

L pAb

1 × 130 µl Dilute 100x in PBS-Tween. Store protected from light.

Protein L reference (600

ng/ml)

1 × 200 µl in 10-0027

5 × 200 µl in 10-0028

Dilute in your reference dilution buffer (see below).

Store working aliquots at -20/-80ºC.

Avoid repeated freezing/thawing

EC-Blue Enhanced™ 1 × 13 ml TMB substrate, ready to use. Store protected from light.

Let the substrate reach room temperature before use.

Stop solution 1 × 7 ml Ready to use.

PBS-Tween tablet 1 × 6 tablets Dissolve 1 tablet in 500 ml ultra-pure water

Plate sealing tape 1 Remove tape cover, seal the plate during incubations.

所需材料但未提供

1。微吸管和吸管，范圍10-1000μl

2。玻璃、管子和機架

3。超純水

4..參考樣品（見樣品制備）

5..水浴

6特克斯混合器

7離心機

8洗瓶或自動微滴板墊圈

9..微滴度平板閱讀器在450n m處讀取吸光度

參考樣品（不含蛋白L的Ig/Ig-碎片樣品）

由于不同的目標(biāo)分子，在不同的濃度下，可能對測定性能有不同的影響，因此需要稀釋t。 蛋白質(zhì)L參考品（在試劑盒中提供）在參考樣品中。參考樣品應(yīng)在等效緩沖液中以與試驗樣品相同的濃度含有相同的Ig或Ig碎片 要進行分析（即。從蛋白質(zhì)L親和層析介質(zhì)中洗脫樣品）。重要的是，參考樣品的ig或igfragments應(yīng)使用另一種p來制備 強化戰(zhàn)略（即。不涉及蛋白質(zhì)L親和層析培養(yǎng)基，例如合適的離子交換柱）。參考樣品和儲存在適當(dāng)?shù)臈l件下，例如。- 用于幾種不同的蛋白質(zhì)LELISA測定。如果您的測試樣本不包含任何Ig或Ig-碎片，請使用您的測試樣本緩沖區(qū)作為參考樣本。

如果需要，將參考樣品的pH值調(diào)整到7.4。在PBS-Tween中稀釋參考樣品至少1：2，以與樣品中的濃度相匹配。·使用這個解決方案（參考文獻dilu） 緩沖液），以稀釋試劑盒中提供的蛋白質(zhì)L參考，以獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線（見下文）

測試樣品-pH和稀釋·

調(diào)整所有樣品的pH值到大約7.4。

在PBS-Tween中稀釋所有樣品至少1：2。確保所有樣品中含有等量的目標(biāo)分子（Ig/） IgG-碎片），與參考稀釋緩沖液中的濃度相同（見上文）。

·對于一些含有Ig-碎片的樣品，可通過調(diào)整終濃度來改進測定結(jié)果 吐溫20%~0.05%。

需要通過煮沸和離心進一步制備含有Ig或Ig碎片的樣品（見下文）。沒有IgG或IgG碎片的樣品可以直接使用。 e化驗。

標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品·

蛋白質(zhì)L參考品應(yīng)稀釋1：10，以達到標(biāo)準(zhǔn)曲線的高點（60ng/ml）。在參考稀釋緩沖液中稀釋蛋白質(zhì)L參考。Th 在1：2的步驟中進行連續(xù)稀釋。參見下表中的示例。旋渦每個樣品，并更換吸管尖，然后再進行下一次稀釋。

Standard (std) 60 ng/ml Add 60 µl Protein L reference to 540 µl Reference dilution buffer 30 ng/ml Add 300 µl std 60 to 300 µl Ref. dilution buffer 15 ng/ml Add 300 µl std 30 to 300 µl Ref. dilution buffer 7.5 ng/ml Add 300 µl std 15 to 300 µl Ref. dilution buffer 3.75 ng/ml Add 300 µl std 7.5 to 300 µl Ref. dilution buffer 1.88 ng/ml Add 300 µl std 3.75 to 300 µl Ref. dilution buffer 0 ng/ml 300µl Reference dilution buffer

如果需要，標(biāo)準(zhǔn)曲線可以以同樣的方式進一步稀釋（低于1.88ng/ml）。

注意：確保總是以與測試樣本相同的方式對待您的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本。如果你的測試樣品含有Ig或Ig-碎片，需要煮沸作為樣品準(zhǔn)備，你的參考。 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品也應(yīng)在相同的條件下煮沸。

空白樣品

PBS-Tween可作為空白樣品..另一種選擇是使用與測試示例相同的緩沖區(qū)。在這種情況下，處理空白樣品的方式與您的測試樣品相同（調(diào)整pH） ，用PBS-Tween稀釋，煮沸）。

煮樣本

這一步是必要的，只有當(dāng)你的樣本包含Ig或Ig-碎片..沒有Ig或Ig-碎片的樣品可直接用于測定..

煮沸試驗樣品、空白樣品和參考標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。使用帶螺旋帽的管子。

如果使用加熱塊，不要使用小瓶與裙子。含鎂樣品應(yīng)煮沸1次 5分鐘。含有Ig-碎片的樣品應(yīng)煮沸1小時..

離心樣品2分鐘。

在將樣品加入盤子之前，在不打亂顆粒的情況下，仔細混合樣品。

注：樣品制備方案可以通過改變煮沸時間和稀釋度來優(yōu)化不同的Ig-碎片。一般來說，較小的目標(biāo)分子需要較長的沸騰時間。

試劑制備·微滴度條準(zhǔn)備使用。

·1PBS-Tween片應(yīng)溶于500毫升超純水中。

所需PBS-Tween的數(shù)量取決于洗滌過程。 再來一次。確保為所使用的程序準(zhǔn)備足夠的PBS-Tween。應(yīng)在PBS-Tween中稀釋HR P共軛抗蛋白LpAb。使用前不久稀釋。

EC-Blue增強TMB底層 已經(jīng)準(zhǔn)備好使用了。

停止解決方案已準(zhǔn)備好使用。

檢查法，檢驗法，試驗過程

使用前讓所有試劑達到室溫.

.1.準(zhǔn)備參考標(biāo)準(zhǔn)品和試驗樣品（pH-調(diào)節(jié)，稀釋，煮沸和離心）..仔細混合樣品，無需再懸浮 在把它們添加到井中之前，先把球團磨碎。建議運行所有樣品一式兩份（見下面建議的板塊布局）..

2.添加100μl/井的參考標(biāo)準(zhǔn)，空白樣本，和Pr 分離測試樣本。

3.封板，室溫孵育2小時..

4.將盤子倒空，用350μl PBS-Tween/井用ELIS A板墊圈清洗3次，或用灌注井的方法清洗3次 用洗好的瓶子到頂部。將平板倒置在吸水紙上，使其在洗滌后*清空。

5.在每口井底部加入100μl稀釋的結(jié)合抗體。小心 不要用抗體溶液污染井壁。

6.封板，室溫孵育2小時..

7.清空盤子，用350μl PBS-Tween/wel洗6次 我使用ELIS A板墊圈，或者用一個清洗瓶把井填到頂部。將平板倒置在吸水紙上，使其在洗滌后*清空。

8.添加100μl EC-Blue E 每口井都有Nhanced（TMB底物溶液）。加入基板后仔細敲擊板。

9.在室溫下孵育10分鐘。讓盤子遠離陽光直射 在孵化過程中。

10.在每口井中加入50μl的停止溶液。保持所有樣品加入底物和停止溶液之間的相同時間間隔。在加入停止溶液后，小心地敲擊板。 一定要混合底物和停止溶液。

11.在450n m處的光密度的光度測量應(yīng)在15分鐘內(nèi)進行。

結(jié)果分析

蛋白質(zhì)L濃度·計算空白樣品

測試樣品和參考標(biāo)準(zhǔn)曲線的A450平均值。

·以減數(shù)校正背景 空白樣品的平均吸光度值。在x軸（對數(shù)標(biāo)度）和A450上繪制蛋白質(zhì)L濃度（ng/ml）從參考標(biāo)準(zhǔn)曲線中獲得的值。 y軸。

如果使用計算機曲線擬合，宜使用四參數(shù)或五參數(shù)Logistic方程.

.通過findi從圖表中獲取樣品中的蛋白質(zhì)L濃度（ng/ml） 相應(yīng)的蛋白質(zhì)L濃度在你的x軸上，從你的樣本值A(chǔ)450在y軸上。

記住調(diào)整樣品稀釋度，以獲得你的ORI中的濃度。 原始樣本。

性能.對于不含Ig或Ig-碎片的樣品，試劑盒的測量范圍至少為0.5-60ng/ml的蛋白L..對于含有Ig的樣品，檢測的靈敏度可能降低 或者ig-碎片。